膠體金在快速檢測中的地位

優良的穩定性、靈敏度、精確度及制造過程中的可重復性,使得膠體金適合基于膜的檢測技術。

快速膜檢測需求廣泛,可應用于諸多領域(見下表)。隨著靈敏度和特異性的提升,大量的潛在應用可能是作為替代昂貴儀器檢測方法的低成本選擇。

快速檢測的應用

臨床醫用
??變態反應
??心梗標志物
??退行性病變
??藥物濫用
??生殖
??法醫
??免疫分型
??感染性疾病
??血清學試驗
??性傳播疾病
應激反應
??毒理學
??腫瘤標記
農業應用
??食品安全
??植物及農作物疾病
環境應用
??生物學污染
環境污染獸醫學應用
(與多數人類臨床應用領域相似)

這篇文章重點講述此種檢測方法中極為重要的組成部分—檢測標記物的生產制造對整個檢測系統的性能及可靠性的影響;尤其是強調了膠體金標記物在此檢測功能中的優勢。

什么是快速檢測?

快速檢測是一種廉價的、一次性的、 基于膜的檢測方法,它能提供分析物存在于液體樣品的視覺證據。這種檢測可以以獨立的試紙條,也可以以裝在塑料盒中的形式進行??偟膩碚f,做此項檢測至少只 需200ul的液體標本,可在2至5分鐘內完成。在臨床檢測中,樣品可能有尿、血液、血清、唾液或其他體液。

在非臨床檢測中,樣本可能是由土壤、粉塵、植物或者食品制備的微量溶液,它們同樣可以直接應用膜試紙條檢測。這種檢測方法無需儀器操作,可應用于臨床、實驗室、室外或者家庭——通常為無操作經驗人員使用。

快速檢測法有兩種形式——層析和滲濾。層析是最普通的形式因為其制造及使用都比較簡易,這兩種形式所涉及的原理雖然相同,但我們這里將要討論的是層析檢測法。
一個快速檢測的底層一般是硝酸纖維素膜,在它上面固定了檢測蛋白,通常是抗體或抗原(圖1)。

側向層析快速檢測試紙條的結構圖

圖1 側向層析快速檢測試紙條的結構圖

連接著膜的是包含有干燥金標的金標墊(通常是玻璃??? 纖維)。對于目前大多數可做的檢測項目,這種結合墊含有吸附了針對待檢分析品的特異性抗體或抗原的金粒子。樣品墊通常為紙質,附著著結合墊。當使用樣品墊 時,液體樣品通過毛 細擴散作用穿移過結合墊,再水化金交聯物,使待分析樣品與交聯物相互作用。然后金交聯物與待分析樣品復合物轉移至膜條帶上再移向蛋白結合物,復合物在此處 被固定后以一條細細的紅線的形式產生明顯的信號。第二條線是控制線,由余下的金交聯物形成于膜上,表明測試完成。

顧名思義,快速檢測應在短時間內提供結果,準確的說是在幾分鐘內。這種檢測法必須方便、精確、可靠、廉價、是一次 性的而且操作簡易的。它們也必須容易和清楚的說明書,甚至是沒有經驗的使用者也能操作。從生產廠家的觀點來看,這種快速檢測將會帶來巨大的附加值,且容易 向世界各地的使用者推廣,而無論使用者其有無此項檢測的經驗(見文后附言)。

快速檢測功能廣泛。改變抗體或者對條帶的化學配方作微小的變動,同樣的設計應能用于多種檢測。

為何使用金標記?

早期的快速檢測使用有色膠乳形成可視信號,目前的某些檢測仍使用此手段。 過去和現在,乳膠法一直是凝集反應主要的標記方法,這是因為它在結合成分的存在下易于凝集。對于快速檢測而言,交聯物的穩定性是避免假陽性的關鍵,而易于凝集可能就是其產生假陽性的主要問題。

因為具有更好的潛在穩定性,20世紀80年代末,金標記被引入膜快速檢測中。在適當的生產條件下,任何被精確大小的金顆粒都可以被重現性制造出來。 不同的大小可用于不同的用途。其優良的穩定性、敏感性、精確性及可重復生產性等特點使得金適合于在快速檢測中的應用。金本性屬惰性元素,被適當加工可形成 完整的球形顆粒。當正確連接時,蛋白質能牢固地結合在金顆粒表面,無論是液態或固態都能保持長久的穩定性。而且,若是在制造過程中蛋白被精確固定,其與金 交聯物的非特異性結合可被減至零。

標記抗體和抗原的不同標記物優缺點的比較如表1所示:

表1.快速檢測中常用標記物的特征比較

特征 乳膠 燃料
重復性 *** * *** *** *** ***
放大性 *** * ** ** ** ***
一步 *** *** ** ** ** *
敏感性 * * *** *** **
多重分析檢測 *** *** * * * **
穩定性 *** *** ** * * *
結果清晰 *** *** *** *** ***
易于制備 *** *** ** ** ** **
使用簡單 *** *** * ** * *
適應性 ** ** ** ** ** ***
低成本 *** *** *** *** *** **
* 應用受限
**適于部分檢測
***效果顯著適于大部分檢測

膠體金的制造

當膠體金被大量生產時,為保證批間重復性及避免不穩定性,成熟的工藝方法是必須的。為獲得最終穩定敏感的產品,生產100升高質量的膠體金就需要極度的細心與仔細以獲得最終穩定及高靈敏度的產品。在生產過程中的每一步都需要使用電鏡檢查來進行質量控制。

金離子還原形成金顆粒

圖2 金離子還原形成金顆粒

在過去的20年里,生產商們引進了各種不同的方法來合成膠體金,目的就是為了獲得直徑一定且均一的單分散性的膠體。盡管所有的生產方法都是依賴于還 原HAuCl4來形成金原子,但其物理條件還是有相當大的差異,如反應物添加的次序、還原劑使用的多寡、以及最終生產出的膠體的質量(大小、形狀、變異系 數等)。

大體來說,所有的生產方法都是使用還原劑提供電子給溶液中帶正電荷的金離子而產生金原子,如下所示:

氯金酸+還原劑=膠體金

HAuCl4 + e– = Au0

通常使用的還原劑包括檸檬酸鈉、黃磷、硼氫化鈉、硫氰酸鈉。圖2所示為不同離子水平還原過程。

在加入還原劑之前,溶液中所含為100%金離子。曲線的縱坐標代表在加入還原劑時金離子轉變為金原子的進程。加入還原劑之后,溶液中金原子的含量立 即出現急劇的上升,直到其達到過飽和。緊接著在一個被稱作核化的過程中發生凝集作用,在核化位點形成由11個金原子構成的中央的二十面體金核心。核化位點 的形成是為了減少溶液中金原子的過度飽和,其形成極其迅速。此過程一旦完成,溶液中剩余的金原子在遞減的能量梯度下繼續結合核化位點直到所有的原子從溶液 中移除。

最初形成的核數目決定了最終將有多少顆粒形成于溶液中,而這個數目又反過來取決于所加入的還原劑的量。還原劑越多產生的晶核越多從而產生的金顆粒也 越多。顯而易見,在一個含既定數目氯化金的溶液中,形成的核化位點的數目越多,最終形成的每個金顆粒的尺寸就越小。因而微粒的大小可通過所加入的還原劑的 量來精細調控。如果生產條件經過優化,所有的核化位點都可以在瞬間同時發生,使得所形成的金顆粒大小都完全一致(即單分散型)。要做到這一點是很困難的。 大多數的生產方法都無法使所有金離子于瞬間同時得到還原并形成核化位點,從而造成核化過程的不均一及多分散性膠體的產生,最終導致產品的重復性低下、交聯 物不穩定。

被包繞雙電子層的膠體金顆粒

圖3 被包繞雙電子層的膠體金顆粒

每個膠體金粒周圍都包繞著來源于溶液中殘留陰離子的負電荷層的金顆粒懸液構成(見圖3),這種被稱作zeta電位的電子層使得金顆粒之間相互排斥并在懸浮液中任意分布。zeta電位可以通過改變周圍溶液中離子的濃度而被壓縮或擴張。

高質量的膠體金和定制加工完好的交聯物方便用于商業用途,通過從信譽度較好的供應商購買這些成分而非試圖自己加工大批量的金不僅可以節省生產廠家的時間還可以減少他們的制作風險。

好膠體金和不好的膠體金

膠體金及交聯物的生產制造表面看似簡易,若掉以輕心則可導致生產出劣質、性能差及重現性極差的產品進而影響其商業用途。將這樣的產品應用于快速檢測 中可能導致結果的低穩定性、低敏感性及低特異性。為防止這樣的結果出現,應使用透射電子顯微鏡(TEM)來評價膠體金的超細微結構。這種檢測能使生產者對 照標準比較膠體的直徑,得到顆粒球狀、顆粒不規則性和顆粒直徑的變化。

優質膠體金與劣質(不穩定)膠體金

圖4 優質膠體金與劣質(不穩定)膠體金

如果還原過程中核化作用及形成速度沒有得到很好控制,粒子的形成就會不均一。(見圖4),所見的粒子可能具有不同的大小及形狀(如橢圓形、三角形、 長方形、菱形等等)。這樣的粒子在與蛋白的結合過程中將無法被均勻包被,也不能在溶液中均勻分布。最終將影響產品的顏色、敏感性、特異性及穩定性。僅僅 5%形狀不均一的粒子都會影響測試的結果,使其完全不具重現性。與代表著制作精良的40nm的單分散性膠體粒子的櫻桃紅色相比,由“劣質金”所形成的信號 ??梢姷降{色或紫色。雖然在檢測系統中白色背景膜上較暗的顏色更容易辨別,但暗示著潛在的不穩定性,而這種不穩定性更容易造成錯誤的結果。更嚴重的是, 粒子形狀及尺寸的不均一會導致蛋白包被的不均一,這樣會導致交聯物長時間的積聚與凝集,儲存于溶液中的交聯物可能于幾天甚至幾個小時內就出現這樣的變化。

即使立即將交聯物干燥于固相基質上也無法完全克服這個問題,在干燥過程中,由于粒子形狀而未穩定結合的表面蛋白很容易分離,造成假陽性及高背景。

快速檢測操作過程中一個最常見的問題就是金交聯物不能以適當的速度及完整形式從玻璃纖維結合墊上釋放,這個問題常常是因為未完全包被的金顆粒直接暴 露在玻璃纖維材料上而不能釋放。這必然意味著表面蛋白或者永久地附著在纖維基質上或離開金顆粒自由飄浮。開始就具備包被均一的單分散性球形粒子再加上制備 完好的金交聯物,可大大減少這種危險問題的發生。

盡管TEM檢測是決定膠體質量的唯一正確方法,但鑒定膠體或交聯物是否包含融合的、凝集的或者不均一粒子亦或含有不同大小粒子群體的快速方法就是目 測它的顏色。優質的40nm(診斷應用中最常使用的粒子大?。┑哪z體應該顯示櫻桃紅色。如果膠體或交聯物出現紫色,很有可能說明其質量低劣且不穩定。

金顆粒大小的選擇

因優化信號選擇金粒子的大小

圖5:因優化信號選擇金粒子的大小

檢測信號是由金顆粒聚集于測試線或控制線而出現的信號。這些粒子必須足夠大到能被看見,粒子的尺寸越大,這些粒子聚集后就越容易被看見。例如1nm 直徑的粒子,無論其聚集數量多少幾乎都是不可能被看見的,因為1nm的粒子沒有更大粒子所具有的亮紅色。只有直徑達到20nm的粒子才會出現可見的信號。 隨著粒子尺寸的增大,位阻現象又成了一個問題(見圖5)。例如,如果IgG(160,000道爾頓)分子僅僅8nm長,大約4nm從金顆粒表面伸展開,那 么,100nm的粒子將會使這些小的表面分子顯得更小而很難與特異性的蛋白相互作用。此外,這些粒子的尺寸越大,它們在既定體積溶液中存在的數量越小。

這種可見度的需要與位阻現象之間的矛盾現象表明,對于大多數的免疫檢測應用而言,最適的粒子大小是40nm.在某些情況下當位阻現象成為較大問題時 (如針對較小的抗原),20nm的粒子則更為合適;當希望出現更深顏色或當分子表面較低的曲率提高了抗原抗體分子間的交互作用,較大一點的粒子則更為可 取。應該由實驗決定確定多少顆粒大小能帶來高靈敏度、淺背景色和高穩定性。

膠體金的制造

制造者必須了解讓他們的蛋白與膠體金持久結合的物理及化學進程,具備了這些知識之后,要進行從小批量制造到大規模生產就變得輕而易舉,而無須以犧牲 產品的敏感性、穩定性、特異性或重現性為代價了。僅僅把交聯物揉合到一起,雖然成本低廉且簡易,卻通常會導致聚集體的形成。通過TEM可以觀察到,每一個 聚集體都是由4個或更多金交聯物分子組成的群體。這種聚集體的存在通常預示著產品的不穩定性,其性能會隨著時間而改變。雖然比較未聚集的產品剛開始具有更 高的靈敏度,但這些產品很快會出現穩定性和特異性的問題。

一種好的交聯物表現為蛋白吸附于金的表面上,與膠乳不同的是,蛋白是被動地吸附于交聯物表面,因而不會出現共價結合。然而,由于某些小分子與金表面 沒有足夠的結合位點;像激素、藥物及其他小分子(<10KD)在被動交聯之前必須先結合到大分子載體上,多為BSA.在任何情況下,位阻現象都會阻 礙小分子升至zeta電位。載體應該是惰性的,這樣就不會影響檢測蛋白質的活性。

抗體的Fc片段緊緊吸附在金顆粒表面上,這樣圍繞著金顆粒的雙電子層表面的Fab片段就突出在外面,這樣Fab就能吸附分析物(見圖6)。膠體金上 標記抗體時,不能有過量的待標記抗體存在。因為過量的游離的抗體會跟膠體金上的抗體與抗原發生競爭反應,導致出現假陰性,而且過量的抗體蛋白會影響到標記 物的穩定性。蛋白質和膠體金結合的最佳條件在蛋白質的等電點附近。

蛋白通過以下機制于幾秒之內吸附于金表面:

抗體與金粒子的結合力
圖6 抗體與金粒子的結合力

(1)?金粒子所帶負電荷與蛋白內氨基酸(如賴氨酸)所帶陽性電荷的最初的相互吸引

(2)蛋白通過某些氨基酸殘基包括色氨酸與金粒子表面之間的疏水吸附作用

(3)蛋白中的半胱氨酸的硫基與金粒子間的配價結合

交聯物的穩定

隨著特異蛋白的結合,交聯物必須用適當的試劑進行穩定,通常使用BSA、明膠、PEG(聚乙二醇)或酪蛋白。使用穩定劑有雙重功能,一是它可通過封閉膠體表面未和特異性蛋白結合的位點而減少了非特異性反應;二是它可有助于更穩定的懸液的形成。

一旦結合,金即被調整至預期的濃度,并混懸于相應的緩沖液中。這種緩沖液應可使液體交聯物穩定,商業生產者常會使用低摩爾濃度緩沖液以使得工業客戶 能簡單重懸交聯物于自己所選的緩沖液中??偟膩碚f,最終的儲存緩沖液不應含有高鹽緩沖液和表面活性劑,因為它們有可能通過水解或置換抗體造成損傷。含有硫 基或汞的防腐劑會造成交聯物的完全毀壞。膠體金最常用的防腐劑為0.1%疊氮化合物。

專業制作出的膠體金的儲藏幾乎是無限期的。通過計算有多少結合劑可吸附到金粒子的表面,可能會減少批間差,其形成的交聯物比單獨的抗體可更長久的儲存;恰當干燥于固相組分的金標蛋白則可保存數年之久。

膠體金的大規模制造

盡管已經有技術及科學的資料來描述出簡單的小量膠體金和交聯物的生產過程,但應用于大批量商業生產(譬如100升的量)時的方法仍舊存在著所有權的 問題。假設從氯金酸至膠體金的還原過程必須于微秒之內完成,那么100升或更大量產品的生產則需要非常精細的技術而不是僅僅遵循著小量產品生產的同一原 則。

由于這些技術僅僅為用于商業生產的金交聯物企業中的專家所熟知,所以大多數生產者不會試圖在企業內部選擇這種艱巨的任務生產大批量的膠體金。相反,快速檢測試劑的生產商會與膠體金專家合作,籍此來減少費用的成本和失敗的危險,同時也可以使得他們的產品盡快走向市場。

這樣的合作安排通常由生產商進行內部的實驗開始,這些實驗使用小量商業用途的膠體來決定何種抗體最適于其應用。隨后,一些企業內部進行更大量的膠體 交聯實驗來決定按比例放大10倍或100倍的產品是否能生產出相同質量的交聯物。在提高溫度和應用不同緩沖液以及干燥狀態下進行此階段的嚴格的金交聯物穩 定性實驗操作是尤其重要的。質量控制應包括使用TEM檢查有關聚集產生的情況、光密度、敏感性及特異性。在進行大批量快速檢測產品的生產之前,多批次地進 行這種大量的實驗來決定生產的重現性是很有必要的。

定量的可能性

大多數的快速檢測只是定性的,只能用于檢測臨床樣本中是否含有超過檢測濃度的特定生物成分存在。然而,有許多的檢測則需要一種定量的元素,例如監控臨床指標的變化或確定特定分析物的相對或絕對濃度。

這樣的檢測包括三種形式,第一種形式是,當進行測試時,許多內在的信號可出現測試結果在視覺上的對比,這種測試僅僅能提供半定量的結果,結果可分為 陰性、弱陽性、中陽性和強陽性。第二種類型,檢測線的反應劑設計成只能結合已知一定量的分析物,任何過量的分析物將會和下一條檢測線結合,產生一個溫度計 式的條帶梯度。

在第三種測試類型中,測試樣品所產生的信號由一個小型的、便攜式的分析儀讀取,并由分析儀將有色的測試線轉換為數字信號,許多這樣一般的條帶測試讀取儀將于近期應用于商業用途。

金標記尤其適合于這種定量或半定量的測試,因為測試產生的信號既精確又具有高度可重復性。大多數的信號是利用光電二極管通過反射標定的刻度尺產生數 字,精確度取決于可被讀取得測試結果的準確程度以及測試條帶產生的可重現性信號的可靠程度。由于金標記的精確度,相對于許多其他類型的標記,其可產生的可 重現性信號具備更高的可靠性。

金標信號的銀增強作用

無論以層析還是滲濾模的形式,快速檢測法通常都可提供與ELISA 試劑盒相似或更高的敏感性。對大多數的待分析物而言,檢測水平達到1ng/ml或更小的量是可能的。然而,也有許多待分析物對這種直接標記系統無法達到足夠的敏感度。

要用肉眼在清晰背景的白色膜條上發現金產生的信號,其敏感度則要受到使用者能力的局限。使用光反射技術的定量方法常常無法達到人類肉眼視覺更大的敏 感性。使用銀來增強金標記強度是一種有價值和前途的技術,它可獲得增加100倍的檢測敏感性。用這種方法將銀溶液應用到測試線,來源于金標記的初期信號 (有時候是肉眼可見的)即可被增強。在應用較小粒子(約5nm)的金交聯物的位置,使用這種間接方法可獲得更大的總體敏感性。通過在一步測試法中摻入銀試 劑就有可能無需任何其它步驟就使信號得到增強,這樣液體樣品的應用便能推進整個反應的進程(見圖7)。所有的反應物(包括金交聯物及增強劑銀鹽)都被干燥 于測試條帶上僅由樣品溶開。

層析快速檢測中銀對金標
圖7層析快速檢測中銀對金標

這種間接的增強技術有望在pg/ml的范圍內對待分析物進行檢測。被干燥后的反應物是穩定的并有可能在聚集之前被引入測試裝置中。由于敏感性的增 強,比目前用于直接標記的測試系統中更小量的樣品也可被檢測出。鑒于銀的增強效果,使得為從前的交聯檢測法無法檢測出的待分析物而研究開發出基于金的一步 檢測法成為可能。

附言:

快速測試要求

基于膜上的快速檢測法可廣泛的應用于臨床。雖然在臨床環境中大多數檢測是由專業的醫療保健人士操作,但越來越多的檢測方法被批準由相對無經驗的家庭 使用者操作使用。為創造可成功應用于這個特殊市場的快速檢測法,生產商必須為這些有或無經驗的使用者周全考慮。除此之外,生產商為了獲得加工處理的效率而 控制成本必須有自己的一套需求。以下是目前快速檢測產生的關鍵要求。

操作簡易 或許操作上的簡易是使得快速檢測在商業上可行的最重要特色。一般而言,這種檢測都是應用多功能且簡單的生化技術而無需或僅需極小的操作經驗即可完成的。面向使用者、提高操作性簡易性的特色包括一步操作法及測試結果易識別的特色。

樣品量小 臨床醫生和家庭使用者都鐘愛測試中僅需極少量樣品這一點,此特色具有眾多優點:收集樣品時無需較多經驗,通常操作速度較快,給患者造成的潛在傷害及疼痛也會較少,同時還能減少浪費。

快速 快速檢測正因這一點而得名。在許多臨床檢測應用中會使用到快速檢測,速度是其根本。根據臨床醫生需求,這種檢測的理想目標就是在3分鐘內提供結果,而許多快速檢測都可滿足這種要求。

靈活 對大多數的檢測而言,若要滿足臨床醫生需要即時出結果就可能要以犧牲檢測結果的質量為代價。對生產商而言,應為快速檢測選擇那些可獲得定性、半定量、或者定量結果而無需大幅置換基底物或反應物的理想的原材料。

臨床應用 要使得快速檢能在臨床環境中得到廣泛應用,它取得的結果必須可與臨床實驗室儀器檢測所提供的相媲美??焖贆z測的理想特征包括高敏感性(<%的假陰 性)、高特異性(<%的假陽性)及長期穩定性(12個月以上),結合良好的檢測設計,既有助于減少金交聯物的應用時產生的假陽性和假陰性,又能增加 測試(交聯物)的長期穩定性,商業用途的金交聯物可達到長達12個月的穩定性。

可靠性 快速檢測的發展造就了大量多樣化的測試片或試劑盒式檢測模式的產生,適用的環境范圍從緊急車輛到家庭環境不等??焖贆z測除了對物理條件不能苛刻外,更要求 其能提供變異系數在5%或更小范圍內的可靠結果。若嚴格地控制生產條件,金交聯物將有助于通過最小化批量生產中的變異提升測試的可靠性。

低廉 欲用于臨床檢測的快速檢測遭到同臨床實驗室檢測一樣全面降價的定價壓力;欲用于家庭使用的快速檢測又遭到同其他廠商相同產品的價格競爭;面對這兩種情形,廠家必須面對每種測試結果都達到低成本的市場需求。

高附加值 為了能在以低價出售的一次性快速檢測中獲利,生產商必須不斷生產以降低產品成本。理想的測試應使用易獲取的高質量的原材料,部件易于大量組裝,這樣才能達到原料及勞動力成本均低廉。要取得這種平衡,原料和試劑則適于使用比手工操作優勢大得多的自動加工處理。

商業接受度 無論是由臨床中受過訓練的專業醫療人士還是毫無經驗的家庭使用者使用,快速檢測的設計必須關注消費者的可接受度。相比令操作者毫不費力操作的產品,令人棘手的儲存及操作形式、難以識別的顏色都是產品難在商業上取得成功的弊端。

結語

當乳膠普遍用于結合物時,快速檢測從20世紀80年代中期開始沒有太大的變化。但自那以后,由于在大量快速檢測法設計中對更高敏感性、可靠性及重現性要求的增加使得金作為交聯物的首選。

制作精良的金試劑無論以液體還是干燥形式存在都具有極大的穩定性。如果繼續有對基于金的快速檢測有更大敏感性和特異性的需求,唯有對膠體金的生產和使用進行嚴格的操作才有可能取得成功。

參考文獻

1、 J Chandler, Assay device and method, 96901447.1. European patent application, British Biocell International.

2、John Chandler, PhD, is the managing director, and Tracey Gurmin and Nicola Robinson are part of the custom consultancy team at BBInternational (Cardiff, Wales, UK)

聲明:本文為丁香園論壇組織翻譯,原文著作權歸IVDT網站所有,譯文著作權歸丁香園網站和譯者所有,引用轉載請注明來自丁香園。

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