蛋白質的濃縮方法



蛋白濃縮方法基本有:


1. 透析袋濃縮法
利用透析袋濃縮蛋白質溶液是應用最廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋(無透析袋可用玻璃紙代替),結扎,把高分子 (6 000-12 000)聚合物如聚乙二醇(碳蠟)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30%-40%濃度的溶液,將裝有蛋白液的透析袋放入即 可。吸水劑用過后,可放入溫箱中烘干或自然干燥后,仍可再用。
主要用于更換蛋白質的緩沖液,有透析袋即可,不需要特殊的儀器。


2. 冷凍干燥濃縮法
這是濃縮蛋白質的一種較好的辦法,它既使蛋白質不易變性,又保持蛋白質中固有的成分。它是在冰凍狀態下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下 冰凍,然后移置干燥器內(干燥器內裝有干燥劑,如NaOH、CaCl2和硅膠等)。密閉,迅速抽空,并維持在抽空狀態。數小時后即可獲得含有蛋白的干燥粉 末。干燥后的蛋白質保存方便,應用時可配成任意濃度使用。也可采用凍干機進行冷凍干燥。
在冷凍狀態下讓揚品種的液體升華


3. 吹干濃縮法
將蛋白溶液裝入透析袋內,放在電風扇下吹。此法簡單,但速度慢,且溫度不能過高,最好不要超過15℃。


4. 超濾膜濃縮法
此法是利用微孔纖維素膜通過高壓將水分濾出,而蛋白質存留于膜上達到濃縮目的。有兩種方法進行濃縮:一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過濾器內,在不斷攪拌之下過濾;另一種是將蛋白液裝入透析袋內置于真空干燥器的通風口上,負壓抽氣,而使袋內液體滲出。
主要針對小體積蛋白質溶液(幾ml)此法更不易引起變性,不過得有濃縮器,不是哪個實驗室都有的。


5. 凝膠濃縮法
選用孔徑較小的凝膠,如SephadexG25或G50,將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數而稱取所需的干膠量。放入冰箱內,凝膠粒子吸水后,通過離心除去。


6. 濃縮膠濃縮法
濃縮膠是一種高分子網狀結構的有機聚合物,具有很強的吸水性能。每克干膠可吸水120ml~150ml。它能吸收低分子量的物質,如水、葡萄糖、蔗糖、 無機鹽等,適宜濃縮10 000分子量以上的生物大分子物質。濃縮后,蛋白質的回收率可達80%~90%。比凝膠應用方便,直接加入被濃縮的溶液中即可。必須注意,濃縮溶液的pH 值應大于被濃縮物質的等電點,否則在濃縮膠表面產生陽離子交換,影響濃縮物質的回收率。


7. 丙酮沉淀法:
試驗要求的儀器簡單,但是常常導致蛋白質變性。


8. 免疫沉淀法:
通過免疫沉淀法,用蛋白質特異性能夠定量能夠分離目的蛋白。有三個步驟組成:首先將特異性抗體加入細胞提取物,第二步加入經化學固定的金黃色葡萄球菌, 以確保形成大量沉淀。這些細菌通過蛋白質A和抗體形成復合物,蛋白質A與免疫球蛋白的Fc部分有高度的親和性?;蛘哒f,純化的蛋白A結合 Sephrarose樹脂,為從細胞提取物中分離出抗原抗體復合物,提供一個固體基質。最后通過洗脫,除去尚未沉淀的雜質。
為了除去已破碎的或固定差的細胞,在用于免疫沉淀(作用)之前可以與纖細地金黃色葡萄球菌細胞,如果要用蛋白質ASephrarose樹脂,參考廠家說明書。


9. 硫酸銨沉淀法:
利用高濃度鹽將蛋白質析出(鹽析),選擇硫酸按是因為:鹽析有效性,pH范圍廣,溶解度高,溶液散熱少,經濟.


10. (低溫)有機溶劑沉淀法:
強調低溫(0-4度以下)是因為10度時蛋白會在有機溶劑中變性,可用乙醇,丙酮等。注意:Mg2+離子,pH值。


11. 聚乙二醇(PEG)沉淀法:
PEG是一個水溶性非離子多聚體,使用PEG時旨在個別情況下才會是蛋白質稍有變性!他溶解是散熱低,形成沉淀的平衡時間短,通常達到30%時蛋白質就會達到最大量的沉淀。

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